溫度梯度PCR是指在退火溫度不太明確時，為了找到*退火溫度，在一臺PCR儀上同時做多管PCR，每一管放在儀器內(nèi)不同列（有的是不同行）上，分別進行PCR（如50℃~60℃可以分6管，分別為50，52，54，56，58，60度），zui后看看哪個溫度的效果。總之是用來進行退火溫度優(yōu)化的。
　　
　　降落PCR是在同一個PCR管內(nèi)進行PCR，只是每個循環(huán)的溫度不同（如每個循環(huán)降1度）。一般兼并引物用這種方法多些。
　　
　　設(shè)計多循環(huán)反應(yīng)的程序，以使相連循環(huán)的退火溫度越來越低。由于開始時的退火溫度選擇為高于估計的Tm值，隨著循環(huán)的進行，退火溫度逐漸降到Tm值，并zui終低于這個水平，用于確保*個引物—模板雜交事件發(fā)生在zui互補的反應(yīng)物之間，即那些產(chǎn)生目的擴增產(chǎn)物的反應(yīng)物之間。盡管退火溫度zui終會降到非特異雜交的Tm值，但此時目的擴增產(chǎn)物已開始幾何擴增，在剩下的循環(huán)中處于*滯后（非特異）PCR產(chǎn)物的地位。由于目標(biāo)是在較早的循環(huán)中避免低Tm值配對，在TD—PCR中應(yīng)用熱啟動技術(shù)。設(shè)計時，退火溫度的范圍應(yīng)跨越15℃左右，從高于估計Tm值至少幾度到低于它10℃。例：一對沒有簡并的引物—模板的計算Tm值為62℃。則：從65℃—>50℃（每2cycles降退火溫度1℃），再在50℃退火溫度下做15個循環(huán)。實驗中如持續(xù)出現(xiàn)假象帶（雜帶），則是因為起始退火溫度太低，或目的擴增產(chǎn)物和非目的產(chǎn)物的Tm值相差無幾，或非目的擴增物以更高的擴增效率擴增，可把退火溫度每降低1℃所需的循環(huán)數(shù)增加到3或4。